任一平:液质技术在食品微量蛋白质定量中的应用

专家观点】蛋白质作为人类机体的重要组成部分,是生命活动的主要承担者。人们在日常生活中也习惯性的将蛋白质的摄入量作为健康饮食的重要指标。2018年6月23日,由国联股份(832340)、食品安全与检测传媒事业部主办的“2018年第十一届中国食品安全检测技术高峰论坛暨首届新技术、新产品、新工艺及优秀工程师推荐评选活动”在杭州盛大召开。浙江清华长三角研究院国家食品安全风险评估中心总工程师任一平做了题为《液质技术在食品微量蛋白质定量中的应用》的报告,就高效液相色谱-质谱联用技术在微量食品蛋白质检测中的创新性运用做了详细的阐述。
   在报告中,任一平介绍到,目前学界对食品中蛋白质定量检测分为五种:一是营养功能性蛋白质的定量,主要指各种动物或人母乳的乳白蛋白,血清蛋白,乳铁蛋白等;二是食品过敏性蛋白质的定量与产品标识,以植物性的花生、大豆、木瓜、坚果和动物的牛奶,甲壳动物,鱼和虾等;三是食品中不同来源蛋白质的定性与定量,包括羊奶制品中其他动物奶的定性与定量,羊肉中狐狸肉的鉴别等;四是致病性微生物毒性蛋白质的定性与定量,主要有金黄色葡萄球菌肠毒素A,B和C1型以及肉毒素等;五是致毒蛋白质的定量,包括蘑菇和藻类毒素。关于大分子的研究历程也由1980年代的基因组学、1990年代的蛋白质组学发展到21世纪的靶向蛋白质组学。
   所谓的靶向蛋白质组学指的是把一个基因组表达的全套蛋白质或一个复杂的混合体系中特定的目标蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科。靶向蛋白质组学的检测对象是针对已确定的目标蛋白质,通过将已知的蛋白质组学数据库与蛋白酶特异性酶切技术相结合,筛查和选择适合的特异肽段,进而在三重四级杆质谱中运用选择反应检测(SRM)或多反应检测模式(MRM)建立相应的定量检测方法。
   任一平指出,近年来,在乳品行业的食品安全事故频发,例如三聚氰胺导致的“结石门”、劣质奶粉引起的“大头娃娃”事件……因此,在GB 10765-2010食品安全国家标准婴儿配方产品中规定,乳基婴儿配方食品中乳清蛋白含量必须满足“≥60%”的设定。在新国标第二法中,有5种(或3种)氨基酸判定法。其基本原理是将样品通过盐酸水解过滤后,与N-羟基琥珀酰亚胺-活性杂环氨基甲酸酯(AQC)衍生。衍生物用液相色谱仪分离、紫外检测器检测,分别测定出其中的五种氨基酸(胱氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸)的含量。根据乳清蛋白占乳蛋白60%时所对应的上述氨基酸的临界值,综合判定乳清蛋白占乳蛋白的含量是否达到60%。然后利用五种安吉全的测定值分别进行单项判定,最后,上述五种单项判定结果中以三种及三种以上相同的判定为最终判定结果。
   在首次使用液相色谱—单四级杆质谱法进行研究时,由于没有考虑热变性的蛋白部分,导致他们的方案被否决。任一平和其团队在此基础上再次展开了研究。这次研究的主要内容集中在特异(指纹)肽段的寻找(蛋白质质谱数据库的查询与运用)、色谱和质谱条件的优化与确定(TQ的MRM的应用)、酶解条件的优化、特异肽段的特异性验证与确认(Q-TOF的全扫描)、内标特异肽的设计与合成、同位素内标物的设计与合成以及方法学验证与样品检测应用上。在会议上,任一现场就如何进行特异肽的确认、选择内标的原则等做了详细的阐述。
   在通过与专家的讨论后,最终肯定了乳清蛋白“高效液相色谱-质谱联用法”的科学性、合理性和创新性。任一平指出,引入蛋白组学的概念是技术上的进步,它解决了热变形蛋白的测定问题。由于此方法在技术层面较为先进,对实验操作人员要求较高,专家建议起草人对方法操作步骤应进一步提高和完善,明确标准品信息以便推广使用,理顺标准中两个方法的关系,提供数据验证两种方法测定结果的可比性,进一步核实转化系数0.6。
   在报告的最后,任一平对高效液相色谱-质谱联用法进行了小结与展望:高效液相色谱-质谱联用法依据蛋白组学分析的理念与数据库,引入酶解、串联质谱相结合,运用同位素标记短肽内标法定量,具有灵敏度高、准确度优,选择性好的特点,已经成功地运用到乳制品中牛α-乳白蛋白含量的检测,为原料的质量提高技术保障。同时适用于不同含量产品中牛α-乳白蛋白的检测,为产品提供技术支持。
   目前该方法已经成功运用于真假羊奶的鉴别与定量、贝塔酪蛋白变异体的定量、花生过敏原的残留定量和母乳中微量蛋白的定量等。
 

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